分子生物学的研究

はじめに

　我々の研究グループは、循環器疾患の病因の解明および新たな治療法の開発を目的として、分子生物学的手法で研究を行ってきた。主に心筋症、心筋炎、急性心筋梗塞症の病態解明を進めている。

1.心筋生検および心筋症に関する研究

　心筋症の概念が臨床的に認識されるようになったのは、1960年代で比較的新しい心臓病である。1980年のWHO/ISFC合同委員会で"原因不明な心筋疾患"を「心筋症」と呼ぶことが提案され、同委員会による定義・分類がほぼ定着した (Br Heart J 1980;44:672)。しかし、1990年代の分子生物学の進歩により、心筋症の病因遺伝子異常が次々と解明されるようになり、心筋症はもはや原因不明とは言えなくなった。このような病因解明の進歩を受けて、WHO/ISFC合同委員会は、1995年に心筋症の定義を"心臓の機能不全を伴う心筋の疾患"と改め、また、臨床指標および病理診断に基づき細かく分類した(Circulation 1996;93:841-842)。このような経緯から、心内膜心筋生検による病理診断は、心筋症を診断する上で必須な検査と言える。

　我々の講座では、1975年から紺野・榊原式心内膜心筋生検を開始し、1983年から独自に開発したロングシース法による右室側心内膜心筋生検を行っている。東京女子医科大学、順天堂大学についで本邦では3番目に開始した施設である。年間100〜180例の心筋生検を施行し、2005年9月現在の心筋生検施行数は、計2,300例に達している。この心筋生検数は、本邦ではトップクラスで、院外症例も多く含まれ、岩手県全体の心筋症の病理診断を行っても過言ではない。心筋生検を行った原疾患の内訳は、拡張型心筋症、肥大型心筋症、心筋炎および高血圧性心臓病が大半を占める。また、他臓器の精査では確定診断に至らなかった全身性疾患（サルコイドーシス、アミロイドーシス、Fabry病、ヘモクロマトーシスなど）の疑いの症例が、心筋生検により確定診断された症例も数多く含まれている。このように、心筋生検は、心筋症のみならず、全身疾患に随伴する二次性心筋症の診断にも有用な検査法と言える。今後は、これまでの病理診断法に、免疫組織化学染色法やin situ hybridization法による分子生物学的手法を加え、病理診断だけでなく、個々の症例の免疫異常や薬効評価まで探求し、オーダーメード医療の実現を目指していきたい。また、カテーテルデバイスの更なる開発を行い、より安全に心筋生検を行うことのできる環境を整備していきた。

　拡張型心筋症は、"心筋収縮不全と左室内腔の拡張"を示す疾患で、その発症メカニズムには、免疫応答の異常が働くと考えられている(Circulation 1996;93:841-842)。また、拡張型心筋症は、難治性心不全に陥り、最も生命予後不良な心筋症である。その1年、5年生存率は85%、50%と報告され、心臓移植の原疾患で一番多い心疾患ある。すなわち、循環器専門医にとって、拡張型心筋症は最も治療に難渋する心疾患で、新たな画期的治療法の開発が急務とされる心疾患の一つである。このような観点から、我々の研究グループは、拡張型心筋症の病因解明や新たな治療法の開発を目的とし研究を行ってきた。拡張型心筋症を対象に様々な免疫応答に関する遺伝子異常について研究し、多くの英文原著を報告している。また、米国心臓協会や欧州心臓病学会などの国際学会でも発表している。

　我々の研究グループは、拡張型心筋症の発症メカニズムについて分子生物学的手法を用いて研究してきた。拡張型心筋症の発症とウイルス感染や炎症性サイトカイン発現との関連について報告し、炎症性サイトカインのうち腫瘍壊死因子-aの発現を拡張型心筋症で高頻度に認め、これと拡張型心筋症の発症との関連を示唆した。さらに、世界に先駆けて拡張型心筋症での腫瘍壊死因子-aおよびその変換酵素の発現を検出し、これらの発現が拡張型心筋症の発症の重要な因子であることをインパクトファクターの高い米国誌に掲載した(研究業績9, 10)。

　しかし、ウイルス感染がどのような機転でサイトカインのカスケードを活性化させるかは不明であった。近年、Toll様受容体が単離クローニングされた。Toll様受容体は、さまざまな細胞（単核球、心筋細胞、肝細胞など）の細胞膜上に存在し、外部刺激（エンドトキシン、細菌、ウイルス、LPSなど）に対する免疫応答の第一段階として働き、炎症性サイトカインの活性化経路へとシグナル伝達するレセプターであることが明らかとなってきた(Nature 1997;388:394-397)。我々は、拡張型心筋症の心筋組織で、toll様受容体がエンテロウイルス遺伝子の増幅を介して発現していることを報告した。

　さらに、最近、サイトカインカスケードの下流に位置し、renin-angiotensin-aldosterone systemによりその発現が調節されるosteopontin (Eta-1)が、心筋組織に発現し、間質コラーンの増生、すなわち、心筋リモデリングに関与していることを明らかにし、これの結果は、欧州心不全学会誌に掲載された。

　今後は、これまでの研究結果をもとに、様々な薬物の拡張型心筋症でのtoll様受容体シグナル伝達機構と炎症性サイトカイン誘導能へ及ぼす影響を明らかする。さらに、toll様受容体シグナル伝達機構による炎症性サイトカインの産生に対する影響を考慮した薬物の選択や新たな治療法の開発を行っていきたい。

* 2.心不全に関する研究

　心不全は、さまざまな循環器疾患により血行動態が破綻した状態を示す症候群である。当講座での心不全（慢性および急性心不全）の年間入院患者数は、年々増加し、年間150人から200人程度あり、心不全患者が全入院患者の約10〜15%程度を占めている。ACC/AHAによる報告では、米国での心不全の罹患率が年々増加し、その罹患者数は約500万人に及び、毎年50万人が新たな心不全と診断されている(Circulation 2001;104:2996-3007)。また、30万人が心不全を直接あるいは二次的原因として死亡し、その死亡者数は年々増加している。本邦での心不全に関する詳細な疫学調査はないが、厚生労働省大臣官房統計情報部資料によると年齢調節死亡率は、虚血性心疾患が減少傾向を示す反面、心不全死亡は増加傾向にあり、心疾患死亡総数の約60%は心不全による死亡が占めている。当講座での心不全の基礎疾患は、心筋症(約30%)が一番多く、次いで虚血性心疾患、その他の心疾患(弁膜疾患、不整脈など)である。

　我々の研究チームは、分子生物学的手法により、心不全の発症に関連するさまざまな遺伝子の発現のメカニズムをin vivoあるいはin vitroな実験系で研究してきた。心不全の発症には、炎症性サイトカインの発現を介した自然免疫応答が重要な役割を果たしていると考えられている(Anker SD et al. Am J Cardiol. 1997;79:1426-1430, Deswal A et al. Circulation 2001;103:2055-2059)。炎症性サイトカインのうち腫瘍壊死因子-aは、陰性変力作用、一酸化窒素合成、心筋アポトーシスおよび間質コラーゲンの増生などの心臓への直接作用を有し、それらの作用が心筋リモデリングの形成に強く関与しているとされている(Nozaki N et al. J Mol Cell Cardiol 1998;30:2003-2012)。

　我々は、ヒト不全心筋での腫瘍壊死因子-aおよび誘導型一酸化窒素合成酵素の検出に成功した(研究業績12)。さらに、世界に先駆けて不全心筋での腫瘍壊死因子-α変換酵素の発現に伴う腫瘍壊死因子-αカスケードの活性化が、不全心筋の形成に重要な役割を果たしていることを報告した。

　腫瘍壊死因子-aは、レニン・アンジオテンシン・アルドステロン系(RAAS)を亢進させる働きを持ち、RAASの亢進は、心筋での間質コラーゲンの増生を促すと考えれらている。我々は、心不全の心筋組織でのアルドスロン変換酵素(CYB11B2)遺伝子の発現を検出し、その発現の程度は、心筋の間質コラーゲンの増生および心不全の臨床的重症度と関連していることを報告した(研究業績12)。このことは、組織RAASが心臓局所に存在することを意味し、組織RAASの亢進は、心筋にオートクラインあるいはパラクライン機序により、心筋リモデリングの形成に関与していると予測される。

　また、心不全では、免疫応答細胞での自然免疫応答の亢進が、その重症度や生命予後に関連していると考えられている。そこで、慢性心不全での末梢単核細胞でのサイトカインカスケードの活性化に着目し研究した。慢性心不全の末梢単核細胞では、腫瘍壊死因子-α変換酵素を介した腫瘍壊死因子-αの産生能が亢進し、その産生能の亢進の程度は、心不全の重症度と関連していた(研究業績3)。さらに、急性心筋梗塞症後の心不全でも同様の結果が得られた(研究業績4)。これらの報告は、免疫担当細胞の活性化が、心臓のポンプ障害に関与をしていることを示唆している。

　C-reactive protein (CRP)は、炎症性サイトカインの誘導により、肝細胞で産生される炎症マーカーである。近年、心疾患では、高感度CRP（ごく微量のCRP）が上昇していることが報告され、肝外でのCRP産生が注目されている。我々は、分子生物学的手法で、心筋組織でCRPが産生されていることを証明した(研究業績2)。

　サイトカインカスケードの下流に位置し、RAASによりその発現が調節されるosteopontin (Eta-1)が、心筋組織に発現し、コラーゲン蛋白の発現を介した間質コラーンの増生、すなわち、心筋リモデリングに関与していることを明らかにした(研究業績1)。

　しかし、我々が検索した遺伝子の発現異常が、心不全の予後に及ぼす影響については不明な点が多く、また、EBMの得られた治療薬がどのような分子生物学的なメカニズムで効果を示しているのかは明らかとなっていない。さらに、これらの薬物の効果には、人種間や個々での差異がないかどうも不明です。そこで、心不全を対象とする研究組織の構築し遺伝子・蛋白解析の実施、薬物の介入試験を行うことにより、本邦独自のEBMの開拓が必要である。

主な論文業績

* 1. Satoh M, Nakamura M, Akatsu T, Shimoda Y, Segawa I, Hiramori K. Myocardial osteopontin expression is associated with collagen fibrillogenesis in human dilated cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 2005;7:755-62.
* 2. Satoh M, Nakamura M, Akatsu T, Shimoda Y, Segawa I, Hiramori K. C-reactive protein co-expresses with tumor necrosis factor-α in myocardium in human dilated cardiomyopathy. .Eur J Heart Fail. 2005;7:748-54.
* 3. Satoh M, Akatsu T, Shimoda Y, Segawa I, Hiramori K, Nakamura M. Activated toll-like receptor 4 in monocytes is associated with heart failure after acute myocardial infarction. Int J Cardiol. 2005; Epub ahead of print
* 4. Shimoda Y, Satoh M, Nakamura M, Akatsu T, Shimoda Y, Segawa I, Hiramori K. Activated tumour necrosis factor-α shedding process is associated with in-hospital complication in patients with acute myocardial infarction. Clin Sci (Lond). 2005; 108:339-47.
* 5. Satoh M, Iwasaka J, Nakamura M, Akatsu T, Shimoda Y, Hiramori K.　Increased expression of tumour necrosis factor-α converting enzyme and tumour necrosis factor α in peripheral blood mononuclear cells in patients with advanced congestive heart failure. Eur J Heart Fail. 2004;6:869-75.
* 6. Satoh M, Nakamura M, Akatsu T, Shimoda Y, Segawa I, Hiramori K. Toll-like Receptor 4 is expressed with Enteroviral Replication in Myocardium from Patients with Dilated Cardiomyopathy. Lab Invest. 2004;84:173-81.
* 7. Satoh M, Nakamura M, Akatsu T, Iwasaka J, Shimoda Y, Segawa I, Hiramori K. Expression of Toll-like receptor 4 is associated with enteroviral replication in human myocarditis. Clin Sci (Lond). 2003;104:577-84.
* 8. Satoh M, Nakamura M, Saitoh H, Satoh H, Akatsu T, Iwasaka J, Masuda T, Hiramori K. Aldosterone synthase (CYP11B2) expression and myocardial fibrosis in the failing human heart. Clin Sci (Lond). 2002;102:381-86.
* 9. Satoh M, Nakamura M, Satoh H, Saitoh H, Segawa I, Hiramori K. Expression of tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme and tumor necrosis factor-alpha in human myocarditis. J Am Coll Cardiol. 2000;36:1288-94.
* 10. Satoh M, Nakamura M, Saitoh H, Satoh H, Maesawa C, Segawa I, Tashiro A, Hiramori K. Tumor necrosis factor-α-converting enzyme and tumor necrosis factor-α in human dilated cardiomyopathy. Circulation. 1999;99:3260-5.
* 11. Satoh M, Saitoh H, Satoh H, Tamura G. Molecular pathogenesis of dilated cardiomyopathy. Review. J Iwate Med Ass. 1999;50 Suppl:619-26.
* 12. Satoh M, Nakamura M, Tamura G, Makita S, Segawa I, Tashiro A, Satodate R, Hiramori K. Inducible nitric oxide synthase and tumor necrosis factor-alpha in myocardium in human dilated cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 1997;29:716-24.
* 13. Satoh M, Tamura G, Segawa I, Tashiro A, Satodate R, Hiramori K. Expression of cytokine genes and presence of enteroviral genomic RNA in endomyocardial biopsy tissues of myocarditis and dilated cardiomyopathy. Virchow Archiv. 1996;427:503-9.
* 14. Satoh M, Tamura G, Segawa I, Hiramori K, Satodate R. Enteroviral RNA in dilated cardiomyopathy. Eur Heart J. 1994;15:934-9.
* 15. Satoh M, Tamura G, Segawa I. Enteroviral RNA in endomyocardial biopsy tissues of myocarditis and dilated cardiomyopathy. Pathol Int. 1994;44:345-51.

海外学会発表

o 1. Satoh M, Nakamura M, Akatsu T, Shimoda Y, Segawa I, Hiramori K. Myocardial osteopontin expression is associated with collagen fibrillogenesis in human dilated cardiomyopathy. Congress of the European Society of Cardiology, Stockholm, September 2005.
o 2. Satoh M, Nakamura M, Akatsu T, Iwasaka J, Shimoda Y, Segawa I, Hiramori K. Myocardial expression of Toll-like receptor 4 associated with enteroviral replication in human dilated cardiomyopathy. Congress of the European Society of Cardiology, Vienna, August 2003.
o 3. Satoh M, Nakamura M, Akatsu T, Iwasaka J, Shimoda Y, Segawa I, Hiramori K. The Expression of Toll-Like receptor 4 associated with enteroviral replication in human myocarditis. American Heart Association, Chicago, November 2002.
o 4. Satoh M, Nakamura M, Akatsu T, Iwasaka J, Segawa I, Hiramori K. Increased expression of Toll-like receptor 4 and tumour necrosis factor-α in patients with severe myocarditis. Congress of the European Society of Cardiology, Stockholm, August 2001.
o 5. Satoh M, Nakamura M, Satoh H, Iwasaka J, Masuda T, Hiramori K. Myocardial expression of aldosterone synthase (CYP11B2) associated with myocardial fibrosis in failing human heart. American Heart Association, New Orleans, November 2000.
o 6. Satoh M, Nakamura M, Satoh H, Iwasaka J, Hiramori K. Myocardial expression of inducible nitric oxide synthase associated with tumor necrosis factor-α and its converting enzyme expressions in human dilated cardiomyopathy. American Heart Association, New Orleans, November 2000.
o 7. Satoh M, Nakamura M, Satoh H, Iwasaka J, Hiramori K. Myocardial expression of aldosterone synthase (CYP11B2) associated with myocardial fibrosis in failing human heart. American Heart Association, New Orleans, November 2000.
o 8. Satoh M, Nakamura M, Segawa I, Masuda T, Hiramori K. Myocardial expression of tumor necrosis factor-α converting enzyme in human myocarditis. American Heart Association, Atlanta, November 1999.
o 9. Saitoh H, Satoh M, Nakamura M, Hiramori K. Myocardial expression of tumor necrosis factor-α converting enzyme and tumor necrosis factor-α in human dilated cardiomyopathy. American Heart Association, Dallas, November 1998.
o 10. Satoh M, Nakamura M, Tamura G, Segawa I, Tashiro A, Satodate R. Inducible nitric oxide synthase and tumor necrosis factor-α in the myocardium in human dilated cardiomyopathy. American Heart Association, New Orleans, November 1996.
o 11. Satoh M, Nakamura M, Tamura G, Makita S, Segawa I, Tashiro A, Satodate R, Hiramori K. Co-expression of inducible nitric oxide synthase and tumour necrosis factor-α genes in endomyocardial biopsy tissues of patients with dilated cardiomyopathy. Congress of the European Society of Cardiology, Amsterdam, August 1995.
o 12. Satoh M, Segawa I, Shibata M, Ichikawa T, Hiramori K. The expression of TNF-α, IL-8 genes and presence of enteroviral genomic RNA in endomyocardial biopsy tissues of myocarditis and dilated cardiomyopathy. Asean Congress of Cardiology, Bangkok, November 1994.
o 13. Satoh M, Segawa I, Tashiro A, Hiramori K, Tamura G, Satodate R. TNF-α, IL-8 and enteroviral RNA in endomyocardial biopsy tissues of myocarditis and dilated cardiomyopathy. Congress of the European Society of Cardiology, Berlin, August 1994.
o 14. Satoh M, Segawa I, Tashiro A, Hiramori K, Tamura G, Masuda T, Satodate R. Enterovirus RNA in endomyocardial biopsy tissues of myocarditis and dilated cardiomyopathy. Congress of the European Society of Cardiology, Nice, August 1993.

研究費補助金

1. 圭陵会学術振興会研究助成? (平成4年度〜平成5年度)

　課題：Polymeraze chain reaction (PCR)法を用いた心筋内エンテロウイルス遺伝子の解析：心筋炎および拡張型心筋症におけるエンテロウイルス遺伝子検出の意義

　研究代表者：瀬川郁夫

2. 厚生省循環器病委託研究費9指−6? (平成9年度〜平成10年度)

　課題：拡張型心筋症における心筋内ICE/Ced-3ファミリープロテアーゼの発現および心筋アポトーシスとの間連について

　研究代表者：佐藤　衛

3. 科学研究費−奨励研究A? (期　間：平成12年度〜平成13年度)　　　　　

　課題：慢性心不全での腫瘍壊死因子-α変換酵素およびその調節因子に関する分子生物学的検索研究

　研究代表者：佐藤　衛

4. 圭陵会学術振興会共同研究助成? (平成12年度〜平成13年度)

　課題：慢性心不全での腫瘍壊死因子-α変換酵素およびその調節因子に関する分子生物学的検索

　研究代表者：佐藤　衛

5. 科学研究費−若手研究 B? (期　間：平成14年度〜平成15年度)

　課題：Toll様受容体を介した拡張型心筋症発症のメカニズムに関する分子生物学的研究

　研究代表者：佐藤　衛